Biosynthesis of a G-Quadruplex—forming sequence and its stabilization by ligands

In addition to the Watson and Crick B-form duplex DNA, G-quadruplexes are four-stranded DNA structures formed in vivo by the self-assembly of guanine-rich sequences. These can be formed by one, two or four separate strands of DNA and present a diversity of topologies, defined by the strand orientation, loop size and sequence. G-quadruplexes can be found in telomeres, immunoglobulin switch regions and gene promoter regions. The biological relevant location on the genome makes these high-order structures an attractive target for drug design and the development of highly specific ligands that bind and stabilize G-quadruplex with therapeutic activity. Herein, the biosynthesis of a novel G-rich quadruplex-forming DNA sequence 58Sγ3 is described by plasmid amplification. The recovery and purification of 58Sγ3 oligonucleotide using size-exclusion chromatography is presented. The G-quadruplex formation is promoted and its topology is determined by circular dichroism. The stabilization of the G-quadruplex structure with quinoline and naphthalene-based derivatives is studied using melting analysis, G4-FID and PCR-stop assays. The results suggest that 58Sγ3 folds into a parallel-stranded G-quadruplex structure in 500 mM KCl buffer and that naphthalene-based ligands bind and stabilize the G-quadruplex structure. The ligands are also found to be quadruplex-specific over duplex DNA and inhibit Taq DNA polymerase. This work provides evidence for G-quadruplex formation within the immunoglobulin switch regions. Furthermore, it is suggested that the novel ligands here reported act as potent specific G-quadruplex binders and may also potentially be used to inhibit genes transcription in tumor cells.Além da forma B Watson e Crick do ADN duplex, os G-quadruplexes são estruturas de ADN de quatro cadeias, formadas in vivo pela auto-associação de sequências ricas em guaninas. Estas podem ser formadas por uma, duas ou quatro cadeias distintas de ADN e apresentar uma diversidade de topologias, definidas pela orientação da cadeia, tamanho dos loops e a sequência. G-quadruplexes podem ser encontrados nos telómeros, regiões de troca das imunoglobulinas e nas regiões dos promotores génicos. A localização biologicamente relevante no genoma faz com que estas estruturas altamente ordenadas sejam um alvo atrativo do desenho de fármacos e o desenvolvimento de ligandos altamente específicos que ligam e estabilizam o G-quadruplex com ação terapêutica. Neste trabalho, descreve-se a biossíntese da nova sequência de ADN rica em guaninas e formadora de G-quadruplex 58Sγ3, utilizando amplificação por plasmídeo. A recuperação e purificação do oligonucleótido 58Sγ3 é efetuada por cromatografia de exclusão molecular. A formação de G-quadruplex é promovida e a sua topologia é determinada por dicroísmo circular. A estabilização da estrutura do G-quadruplex com ligandos derivados de quinolina e naftaleno é estudada utilizando ensaios de estabilização térmica no dicroísmo circular, G4-FID e PCR-stop. Os resultados sugerem que 58Sγ3 adota uma estrutura G-quadruplex paralela em tampão 500 mM KCl e que os ligandos de naftaleno ligam e estabilizam a estrutura do G-quadruplex. Os ligandos demonstraram também ser específicos do G-quadruplex em relação ao ADN duplex além de inibir a Taq ADN polimerase. Este trabalho fornece evidência da formação de G-quadruplex nas regiões de troca das imunoglobulinas. Além disso, sugere que os derivados de naftaleno atuam como ligandos do G-quadruplex e que podem ser potencialmente utilizados para inibir a transcrição de genes em células tumorais

G-quadruplex aptamers for cervical cancer therapy

Annually, more than 500,000 new cervical cancer cases are diagnosed worldwide with a 60% mortality rate. In Portugal, about 750 new cases are annually diagnosed which in 2018 resulted in 340 deaths. Human papillomaviruses (HPVs) are the principal cause for the development of cervical cancer. High-risk HPV types 16 and 18 are responsible for 70% of all cases. Persistent HPV infection leads to the hyperproliferation of the infected cells by downregulating epithelial differentiation, epidermal development, and innate immune responses. The oncogenic potential of high-risk HPV types is attributed to the expression of oncoproteins, E6 and E7, which inactivate tumour suppressor p53 and members of retinoblastoma family, leading to carcinoma development. Despite recent progresses in screening and HPV vaccination that reduced cervical cancer incidence, treatment options for women with persistent HPV infection or in its latent form are still missing. Furthermore, the available therapeutic options for cervical cancer have limited effectiveness and specificity, causing great pain to patients, and do not benefit from the research addressing the host-HPV interaction patterns during malignant progression. The genome of HPV is divided into 3 regions: a long control region (LCR) that contains cis-elements necessary for the replication and transcription of viral DNA; the early region, composed of six open reading frames (ORFs) labelled E1−E7, and a late region with two ORFs coding for capsid structural proteins L1 and L2. Recently, several guanine-rich regions have been found in the genome of ten HPV types (both high- and low-risk), and the potential of the sequences to fold into stable G-quadruplex (G4) structures was demonstrated. These guanine-rich regions are present in LCR, E1, E4 regions and L2 protein coding sequence, which are involved in transcription, replication, and viral proteins production. Hence, targeting these G-rich regions of the HPV genome could serve as a potential antiviral strategy, using small ligands that can stabilize the viral G4 regions and regulate gene expression. Nucleolin is overexpressed in the surface of cervical cancer cells and was shown to be involved in the activation of HPV18 oncogene transcription in cervical cancer and to be related with HPV16 genome stability maintenance. Nucleolin is present in the nucleus, cytoplasm, and cell surface. The roles of cell-surface nucleolin in tumorigenesis, angiogenesis, and cancer signalling pathways have also been described. Therefore, nucleolin is an attractive target for the development of targeted therapies for both cervical cancer and HPV infection given its high abundance, its multifaceted influence on oncogenesis and virulence of HPV, and its selective presence on the plasma membrane of cancer cells, but not on untransformed, normal cells. AS1411 is a nucleolin-targeted G4 aptamer with antitumoral effect in many cancers that has also been extensively used for the tumour-specific delivery of both therapeutic and imaging agents. This thesis innovates by proposing the development of aptamer-based carriers of antiviral/anticancer G4 ligands as a new therapeutic strategy for HPV infection and cervical cancer. Firstly, several G4-specific ligands belonging to different aromatic scaffolds such as indole, phenanthroline and acridine, were synthesized and characterized for their ability to bind G4 structures, either found in the cancer cell genome (oncogene promoter and telomeric G4s) or the HPV genome. Their effect in inhibiting key G4-dependent processes was demonstrated by their potential to inhibit Pif1 helicase and Taq polymerase enzymes, and to downregulate c-MYC oncogene expression. The ligands demonstrated interesting antitumoral effects in cervical cancer cell lines, particularly ligand C8, which was also found to inhibit HPV18 replication and encapsidation in organotypic raft cultures, with resulting antiproliferative effects in infected tissue. Having established the ability of the ligands as anticancer/antiviral agents, the development of an aptamer-based delivery system was envisioned. AS1411 aptamer and its derivatives AT11, AT11-L0 and AT11-B0 were used to selectively convey the G4 ligands to HPV-positive cervical cancer cells, with a simple non-covalent conjugation strategy and mediated by cell-surface nucleolin recognition. This strategy proved to be efficient at accumulating the ligands in cervical cancer cells, improving their antitumoral effect while limiting their off-target toxicity towards normal cells. Interestingly, because the used aptamers are also G4-forming sequences, the presence of the G4 ligands improved the aptamers’ properties such as cellular penetration and serum nuclease resistance, without affecting nucleolin recognition. Finally, advanced and intricate drug delivery systems were developed aiming at enhancing the clinical applicability of the anticancer/antiviral agents. AS1411-decorated nanoaggregates were synthesized to encapsulate the G4 ligands, allowing their sustained and targeted release within HPV-positive cells in precancerous and cancerous stages. The nanoaggregates presented small sizes (nanoscale), negative surface charge, stability, and a suitable drug release profile. The presence of AS1411 on the nanoaggregates surface as a cancer-specific guiding agent promoted the specific accumulation of the G4 ligands in cervical cancer cells which inhibited their growth, with little effect on non-malignant normal cells. The nanoaggregates were also able to penetrate cervix tissue biopsies of patients with HPV infection in precancerous stages, demonstrating the potential of this system to treat HPV infection in its latent stage, preventing oncogenesis and cervical cancer progression. The administration route of the drug-loaded nanosystems was also addressed. The C8-loaded nanoaggregates were formulated as a gel for local application in the female genital tract, specifically tissue with precancerous lesions and/or HPV infection. Preliminary ex vivo permeation studies using porcine vaginal tissue demonstrated the efficacy of the formulation in penetrating and accumulating the nanosystems in the target cells. Overall, the research performed throughout this doctoral thesis defined improvements in the design of G4-specific compounds with dual anticancer/antiviral effects and led to the discovery of potential aptamer-based delivery systems for G4 ligands. The original results obtained during the past years provide important knowledge in the applicability of G4 nucleic acids for the development of specific and effective therapeutics against HPV virulence and oncogenesis. Furthermore, the encouraging pre-clinical evaluation performed on the newly developed nanomedicines demonstrated the need of continuing the research initiated by this project, particularly by pursuing the in vivo studies to verify the clinical applicability of these systems. In the future, a similar strategy could be extended to the treatment of other types of cancers (for instance HPV-induced oropharyngeal cancers) and other viral infections such as HIV, hepatitis virus and SARS-CoV-2.Anualmente, mais de 500 mil novos casos de cancro do colo do útero são diagnosticados, com uma taxa de mortalidade a rondar os 60%. Em Portugal, cerca de 750 novos casos são diagnosticados anualmente, que em 2018 resultaram em 340 mortes. Os vírus do papiloma humano (VPHs) são a principal causa do desenvolvimento de cancro do colo do útero. Os VPHs de alto-risco do tipo 16 e 18 são responsáveis por 70% de todos os casos. A infeção persistente por VPH leva à hiperproliferação das células infetadas, através da inibição da diferenciação epitelial, do desenvolvimento epidérmico e da resposta imune. O potencial oncogénico dos VPHs de alto risco é atribuído à expressão das oncoproteínas E6 e E7, que inativam o gene supressor de tumores p53 e membros da família do retinoblastoma, levando ao desenvolvimento de carcinomas. Apesar dos recentes progressos no diagnóstico e vacinação contra o VPH, que reduziram a incidência de cancro do colo do útero, ainda não existe tratamento para mulheres infetadas com VPH. Além disso, as terapias existentes para o cancro do colo do útero tais como quimioterapia, radioterapia e cirurgia, têm eficácia e especificidade limitadas, causando sofrimento aos pacientes, e não beneficiam da investigação sobre os padrões de interação hospedeiro-vírus durante a oncogénese. O genoma do VPH está dividido em 3 regiões: uma região denominada RLC que contém elementos cis necessários à replicação e transcrição do ADN viral; uma região prematura composta por seis fases de leitura aberta que codificam as proteínas E1 - E7; e uma região tardia com duas fases de leitura aberta codificando as proteínas estruturais da cápside, L1 e L2. Recentemente, foram encontradas várias regiões ricas em guaninas no genoma de dez tipos de VPH e o potencial destas sequências formarem estrutura estáveis de G-quadruplex (G4) foi demonstrado. Essas sequências ricas em guanina estão presentes nas regiões RLC, E1, E4 e na sequência codificante da proteína L2, que estão envolvidas na transcrição, replicação e produção de proteínas virais. Assim, o desenvolvimento de moléculas capazes de reconhecer e ligar essas regiões ricas em guaninas do genoma do VPH pode servir como uma estratégia antiviral, dado o seu potencial de regular a expressão de genes virais. A nucleolina é uma proteína sobrexpressa na superfície das células cancerosas do colo do útero e que demonstrou estar envolvida na ativação da transcrição de oncogenes do VPH18 e também na manutenção da estabilidade do genoma do VPH16. A nucleolina está presente no núcleo, no citoplasma e na membrana plasmática e foi descrita por estar envolvida na carcinogénese, angiogénese e em vias de sinalização do cancro. Por isso, esta proteína é um alvo atraente para o desenvolvimento de terapias direcionadas para o cancro do colo do útero e a infeção por VPH, devido à sua elevada expressão, múltiplos efeitos na oncogénese e virulência e a sua presença seletiva na membrana plasmática das células cancerosas, mas não em células normais. O AS1411 é um aptamero G4 direcionado à nucleolina, que apresenta efeito antitumoral em vários cancros, cuja aplicação se estende também à entrega específica de agentes terapêuticos e de diagnóstico a tumores. Esta tese inova ao propor o desenvolvimento de transportadores de ligandos de G4 baseados em aptameros, como uma nova estratégia terapêutica para infeção por VPH e cancro do colo do útero. Inicialmente, vários ligandos específicos de G4 foram sintetizados, pertencentes a diferentes grupos funcionais aromáticos, como indol, fenantrolina e acridina. Depois avaliou-se a sua ligação a estruturas G4, encontradas no genoma das células cancerosas (promotor de oncogenes e G4s teloméricos) ou no genoma do VPH. O seu efeito inibitório de processos dependentes de G4 foi demonstrado pelo potencial para inibir as helicase Pif1 e a polimerase Taq, assim como para regular negativamente a expressão do oncogene c-MYC. Os ligandos demonstraram efeitos antitumorais promissores em linhas celulares do cancro do colo do útero, particularmente o ligando C8, que também inibiu a replicação e encapsidação do VPH18 em culturas organotípicas, inibindo a proliferação do tecido infetado. Tendo estabelecido a capacidade dos ligandos como agentes anticancerígenos/antivirais, iniciou-se o desenvolvimento de um sistema de entrega de ligandos baseado em aptameros. O aptamero AS1411 e seus derivados AT11, AT11-L0 e AT11-B0 foram usados para entregar seletivamente os ligandos de G4 a células cancerosas do colo do útero, utilizando uma estratégia simples de conjugação não covalente, mediada pelo reconhecimento da nucleolina na superfície das células. Essa estratégia foi eficiente na acumulação dos ligandos nas células do cancro do colo do útero, melhorando o seu efeito antitumoral e limitando sua toxicidade para as células normais. Uma vez que os aptameros usados também são sequências formadoras de G4, a presença dos ligandos melhorou as propriedades dos aptameros, tais como a penetração celular e resistência às nucleases séricas, sem afetar o reconhecimento de nucleolina. Finalmente, foram desenvolvidos sistemas mais avançados, com o objetivo de melhorar a aplicabilidade clínica dos agentes anticancerígenos/antivirais. Nanoagregados funcionalizadas com AS1411 foram sintetizadas por forma a encapsular os ligandos G4, permitindo sua libertação gradual e direcionada nas células positivas para VPH em fases pré-cancerosas e cancerosas. Os nanoagregados apresentaram tamanhos pequenos (escala nano), carga superficial negativa, estabilidade e perfil adequado de libertação dos ligandos. A presença de AS1411 na superfície do nanoagregados como agente de direcionamento tumoral, promoveu a acumulação nas células cancerosas do colo do útero, inibindo o seu crescimento, com pouco efeito nas células normais. Notavelmente, os nanoagregados também foram capazes de penetrar biópsias do cérvix uterino de pacientes com infeção por VPH em estadios pré-cancerosos, demonstrando o potencial deste sistema para tratar o VPH numa fase inicial da infeção, travando a oncogénese e progressão do cancro do colo do útero. A via de administração dos nanossistemas foi também abordada. Os nanoagregados foram formuladas como um gel semissólido para aplicação local no trato genital feminino, especificamente tecido com lesões pré-cancerosas e/ou infeção por VPH. Estudos preliminares de permeação ex vivo usando tecido vaginal porcino demonstraram a eficácia da formulação em penetrar e acumular os nanossistemas nas células alvo. No geral, a investigação realizada ao longo desta tese de doutoramento definiu melhorias no desenho de compostos específicos para G4 com efeitos anticancerígenos/antivirais e levou à descoberta de possíveis sistemas de entrega baseados em aptameros para ligandos de G4. Os resultados obtidos forneceram um conjunto de conhecimentos sobre a aplicabilidade dos ácidos nucleicos G4 para o desenvolvimento de terapias específicas e eficazes contra a virulência e oncogénese do VPH. Além disso, a encorajadora avaliação pré-clínica realizada nas nanopartículas desenvolvidas demonstrou a necessidade de continuar a investigação, particularmente através da realização de estudos in vivo para verificar a aplicabilidade clínica desses sistemas. No futuro, uma estratégia semelhante pode ser alargada ao tratamento de outros tipos de cancro (por exemplo, cancros da orofaringe induzidos pelo HPV) e outras infeções virais, como HIV, vírus da hepatite e SARS-CoV-2

Gestão pública II: relatos, pesquisas, experiências e visão de trabalho.

Coletânea de trabalhos publicados e premiados no II Seminário de Gestão Pública da UFRA e na 1ª edição do Prêmio Novos Ventos de Gestão Pública, sob a responsabilidade da Pró-Reitoria de Gestão de Pessoas (PROGEP).UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIAEste livro, na forma de coletânea, se constituiu em um processo mais amplo de reflexão sobre a gestão pública dentro da Universidade. Aqui, partimos para uma importante reflexão, a partir do processo de sistematizar experiências, relatos de experiência, e pesquisas, sobre a Universidade Pública e sua relação com as pessoas e as ciências. Em especial, o capítulo 1, a partir da coletânea dos trabalhos apresentados no II Seminário de Gestão Pública, diferencia-se dos trabalhos submetidos para a primeira edição. As experiências destacadas para este livro reforçam a identidade e missão da UFRA, como os resultados dos trabalhos “OS CAMINHOS DA MERENDA ESCOLAR: análise da logística na cadeia de suprimentos do município de Tomé-Açu” e “ANÁLISE QVT NA GESTÃO DE UMA EMPRESA PRODUTORA DE DENDÊ EM TOMÉ-AÇU/PA”, e que também agregam valor a gestores e equipes de trabalho quando promovem a discussão de temas relacionados ao dia-a-dia do trabalho, tais como: QUALIDADE DE VIDA NO TRABALHO e GESTÃO ESTRATÉGICA DE PESSOAS NO SETOR PÚBLICO. Nesse sentido, servidores e pesquisadores cumprem a função de embasar inúmeras discussões que vêm sendo travadas pelas Instituições Públicas sobre qualidade de vida, inclusão, garantia de direitos, melhoria de procedimentos, dentre outros. O capítulo II, enquanto coletânea das experiências de trabalho indicada para premiação, é um momento riquíssimo de se perceber a quantidade e a qualidade de ações planejadas, organizadas e realizadas por servidores públicos. Em tempos que algumas práticas do serviço público não são bem vistas, reforça-se aqui que alguns dos relatos foram concebidos em meio a falta de recursos financeiros e estruturais, mas que não impediram os proponentes de seguir em frente. Mais do que isso, o reconhecimento dos beneficiários e usuários faz com que reforcemos a necessidade de fortalecer ações que agregam inúmeros valores a vida laboral dos servidores públicos e a própria Universidade Pública.This book, in the form of a collection, constituted a broader process of reflection on public management within the University. Here, we start an important reflection, based on the process of systematizing experiences, experience reports, and research, about the Public University and its relationship with people and the sciences. In particular, chapter 1, from the collection of works presented at the II Seminar on Public Management, differs from the works submitted for the first edition. The experiences highlighted for this book reinforce UFRA's identity and mission, such as the results of the work “THE PATHS OF SCHOOL BREAKFAST: analysis of logistics in the supply chain in the municipality of Tomé-Açu” and “QVT ANALYSIS IN THE MANAGEMENT OF A PRODUCING COMPANY OF DENDÊ IN TOMÉ-AÇU / PA ”, and which also add value to managers and work teams when promoting the discussion of topics related to day-to-day work, such as: QUALITY OF LIFE AT WORK and STRATEGIC PEOPLE MANAGEMENT IN THE PUBLIC SECTOR. In this sense, civil servants and researchers fulfill the function of supporting numerous discussions that have been held by Public Institutions on quality of life, inclusion, guarantee of rights, improvement of procedures, among others. Chapter II, as a collection of work experiences indicated for awards, is a very rich moment to realize the quantity and quality of actions planned, organized and carried out by public servants. In times when some public service practices are not well regarded, it is reinforced here that some of the reports were conceived amid a lack of financial and structural resources, but that did not prevent proponents from moving forward. More than that, the recognition of beneficiaries and users makes us reinforce the need to strengthen actions that add innumerable values ​​to the working life of public servants and the Public University itself